采用德国IFP试剂盒测定保健食品中生物素含量

　　生物素(biotin)又名维生素H、维生素B7，作为羧化、脱羧和脱氢反应酶系的辅助因子，参与机体的脂类、蛋白质、碳水化合物跟核酸的代谢，是参与机体三大代谢的重要物质。生物素作为一种营养补充剂被广泛的应用于营养强化剂类保健食品中。

　　目前，用于生物素测定的方法有微生物法、高效液相色谱法、荧光分光光度法、酶联免疫法、毛细管电泳法和毛细管电色谱法等，但国标方法中尚无保健食品中生物素含量的测定方法。微生物法是利用植物乳杆菌(Lactobacillusplan-tarum)对游离生物素的特异性和灵敏性，定量测定出试样中待测物质的含量。该法适用于准确测定营养强化剂类保健食品中生物素的含量，已被保健食品生产企业作为日常质量控制的重要手段，并且这是一种可以达到痕量级的生物素检测方法。本实验采用德国IFP生物素试剂盒对保健食品中生物素进行测定，结果表明该方法简便、快速、专属性强、准确性高。

　　1 实验器材

　　德国IFP生物素试剂盒，其组成为:96孔酶标板，包被有植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，生物素标准品，无菌蒸馏水，生物素测定用培养基，粘合箔，微孔架。MAX190紫外-可见连续光谱酶标仪，隔水式恒温培养箱，无菌滤膜，微生物实验常用试剂及仪器。

　　2 实验方法。

　　2.1 样品处理。

　　根据样品中生物素的含量确定稀释倍数，确保落在标准曲线范围内。取每批样品各10片，除去包衣，研磨成粉，混匀后称取1．0g样品(精确至0．1mg)至1000ml容量瓶中，用灭菌注射用水定容。再量取1．0ml至带塞锥形瓶中，用灭菌注射用水加至40ml，摇匀，用1mol/LNaOH调pH至8.0±0.2。在95℃水浴提取30min，期间摇匀5次，然后迅速冷却至室温，并用0．2靘无菌滤膜过滤至无菌离心管中，再对样品滤液进行稀释备用。

　　2.2 标准品溶液制备

　　照试剂盒中生物素标准品瓶签上规定量加入无菌蒸馏水，摇匀，作为标准品储备液，根据表1制备成不同浓度的标准曲线。

　　2.3 生物素测定用培养基配制

　　先用无菌镊子取出生物素测定用培养基瓶中的干燥剂，再加入10ml无菌蒸馏水，摇匀，95℃水浴5min，期间摇匀2次，然后迅速冷却至室温，并用0.2靘无菌滤膜过滤培养基至无菌离心管中备用。

　　2.4 加样和培养

　　取出所需数量的微孔条置于微孔架上，未使用的微孔条立即放回原来的箔袋中，并与干燥剂一起封好，储存在2～8℃条件下。用无菌微量移液器分别吸取150靗样品溶液和标准品溶液于微孔中，每个做3个重复，微孔板加样分布见表2。加样后每个微孔再加入150靗生物素测定用培养基。

　　用粘合箔盖住微孔条，使其充分封闭微孔板条。避光置于37℃培养44～48h。

　　2.5 酶标仪读数和结果计算

　　培养结束后，将微孔板板面向上放置于台面，平面震荡，使菌悬液均匀分布于培养体系中，小心揭去粘合箔，在630nm条件下，用酶标仪读取吸光度。

　　3 实验结果

　　推荐在计算结果时使用ＲIDAWIN软件，采用4参数曲线分析方法进行结果计算。当标准曲线S0的吸光度值小于S1的值，且S5的吸光度值大于0．6时，表明本次检测结果有效(标准曲线图略)。测得标准曲线回归系数Corr．coeff为0.9974，标准曲线6个浓度的变异系数小。样品的测定结果如表3所示，3批样品的吸光度值均落在标准曲线范围内，得出每100g样品中生物素的含量。

　　4 讨论

　　操作过程中要注意避免微生物对检测体系的污染，经无菌滤膜过滤后的操作步骤应为无菌操作。加样完毕用粘合箔盖住微孔条时，需要特别注意边缘微孔的密封性，最好使用刮板将粘合箔与微孔板条充分密闭。

　　检测所用的玻璃器皿须严格清洗及灭菌，玻璃器皿清洗后要放入200℃烘箱加热2h，减少有机物质干扰的可能。采用IFP微孔板试剂盒测定生物素含量有其操作简单、灵敏度高、处理量大的优势，本方法与国标GB5413．19－2010相比，大大降低了菌种在保存、传代中发生污染和突变的可能性，以及菌液中生物素残留导致测定结果的不准确。吸光度读取的时间一致，有利于减少系统误差，提高了实验结果的准确性。相比其他仪器法测定生物素含量，微生物法的分析检出极限可以达到靗级，明显低于仪器法。

　　参考文献:

　　［1］王欣，王燕，高晓娟，等．常用生物素测定方法的简介［J］．现代化工，2011，31(2):89－94
　　［2］GB5413．19－2010．婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定．2010.
　　［3］黎旭茹，张沁，刘春丽．应用自动浊度微生物分析仪测定维生素片剂中的生物素［J］．广州医药，2006，37(6):58－60
　　［4］肖晶，杨大进，张馨之．高效液相色谱法测定保健食品中的生物素［J］．中国食品卫生杂志，2006，18(3):234－236.
　　［5］刘进玺，钟红舰，董小海，等．超高效液相色谱-质谱联用测定维生素预混合饲料中生物素含量［J］．分析实验室，2010，29(7):62－64．